本文字数：字
阅读时间：3分钟
发表期刊
Microbiologyopen
影响因子
2.
新型隐球菌（C.neoformans）是人类重要的机会性真菌病原体。大量文献表明Mg2+稳态在真菌生物学过程中起重要作用，但是Mg2+在调节人类真菌病原体的毒力因子中的作用仍然大部分未知。本文系统地研究了C.neoformans镁转运蛋白在控制细胞内Mg平衡和毒力相关因子中的功能。作者确定了C.neoformans中的三种镁转运蛋白：Mgt1，Mgt2和Mgt3，并发现GAL7p-Mgt2菌株在葡萄糖存在下显示出显著的Mg依赖性生长缺陷。进一步分析表明，MGT2是酿酒酵母中MNR2的同源物，定位于液泡膜并参与细胞内Mg的转运。转录组分析表明，敲除MGT2差异调节个基因的表达。其中，19个基因受到独立于外源Mg的MGT2敲除的影响。在动物感染模型中，由于囊体结构增大，mgt2突变体在肺组织中表现出提高的真菌负荷。
RNA-seq材料：野生型菌株H99和MGT2敲除菌株GAL7p-MGT2
测序平台：Illumina
测序公司：上海派森诺生物科技股份有限公司
蛋白质系统进化分析鉴定新型隐球菌镁转运蛋白
为了鉴定新生隐球菌中的Mg2+转运蛋白，采用蛋白质系统发育分析。在C.neoformans的蛋白质组数据库中发现了三种酿酒酵母Mg2+转运蛋白同系物，这些被分别重命名为Mgt1，Mgt2和Mgt3。系统发育分析显示，Mgt1与酿酒酵母线粒体Mg2+转运蛋白分组，Mgt2与血管Mg2+转运蛋白具有密切的进化关系，Mgt3与质膜Mg2+转运蛋白相似（图1）。由于许多金属转运蛋白的基因表达受环境金属水平的调控，因此实时PCR检测MGT1，MGT2和MGT3对Mg2+升高反应的内源性表达水平（图2）。数据显示，C.neoformansMg2+转运蛋白编码基因的表达不受环境Mg水平的调控。
图1酿酒酵母和新型隐球菌中镁转运蛋白系统进化树
图2Mg2+升高对内源性MGT1，MGT2和MGT3表达水平的影响
突变体菌株确定Mg转运蛋白维持Mg2+平衡的功能
使用靶向同源整合方法构建Mg2+转运蛋白敲除菌株，获得mgt1Δ，mgt3Δ和mgt1Δmgt3ΔMgt2；通过在MGT2ORF的起始密码子之前插入的新生隐球菌半乳糖调节启动子（GAL7，CNAG_：编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因）取代MGT2启动子，构建了GAL7p-MGT2菌株。与野生型菌株相比，mgt1Δ，mgt3Δ和mgt1Δmgt3Δ菌株具有相似的细胞生长速率。当Mg补充到培养基中时，GAL7p-MGT2菌株的细胞生长得到挽救，但不与其他金属一起（图3a和b）。使用原子吸收光谱测量细胞镁含量，数据显示GAL7p-MGT2菌株中Mg2+含量降低了50％（图3c）。这些结果强烈表明，Mgt2蛋白是参与细胞内镁积累的关键新型隐球菌Mg转运蛋白。
图3Mg转运蛋白突变体的生长表型
新型隐球菌的Mgt2定位在液泡膜
为了评估Mgt2是否功能上类似于Mnr2，构建了可以在半乳糖诱导型启动子的调节下表达GFP-Mgt2嵌合蛋白的GAL7p-GFP-MGT2菌株。GAL7p-GFP-MGT2菌株在YPD（酵母蛋白胨右旋糖）上产生与GAL7p-MGT2菌株相似的生长表型，且在半乳糖存在下补充生长表型（图4a），表明这是GFP-Mgt2蛋白特异性的功能。使用共聚焦显微镜来显示GFP-Mgt2定位于液泡膜（图4b）。液泡特异染料FM4-64和GFP的荧光信号共定位在液泡膜上，表明Mgt2是液泡Mg2+转运蛋白（图4c）。
图4C.neoformansMgt2是一种液泡镁转运蛋白
RNA-Seq验证Mgt2调节独立于Mg的基因表达
抑制MGT2的表达导致个基因的差异表达。在所有差异表达的基因中，MGT2的表达在GAL7p-MGT2细胞中最显着下调。将Mg添加到GAL7p-MGT2菌株的培养基中，与仅在YPD中的GAL7p-MGT2细胞相比，引起GO富集的显着变化。然而，不论Mg处理如何，在这两个条件下，都有四个GO条件保持不变，而这些GO条件在碳水化合物转运，单一生物转运，单一生物定位和有机物质转运方面显着富集（图5b）。在存在或不存在外源Mg的情况下，YPD中GAL7p-MGT2细胞中19个基因的表达保持不变，并且包括MGT2本身。对19个基因中的5个随机选择的预测靶基因进行实时PCR以评价RNA-seq数据，其表达调控模式与RNA-seq分析中获得的类似（图6）。
图5RNA-Seq实验设计及测序结果的GO富集和Venn图分析
图6RT-PCR验证RNA-Seq测序结果
小鼠体内验证Mgt2影响新型隐球菌在肺中的存活
通过统计突变体mgt1Δmgt3Δ或GAL7p-MGT2菌株感染C57BL/J小鼠存活率，检测肺中两个独立的GAL7p-MGT2菌株的真菌增殖水平等一系列实验，结果表明Mgt2可能参与被膜形成。为了进一步了解Mgt2影响肺部真菌增殖的机制，作者分析了GAL7p-MGT2菌株中的黑色素和被膜形成，并表明Mg2+是C.neoformans黑色素形成的关键因素，Mgt2是必需的。后续又构建了Mgt2过表达菌株，检测Mg2+浓度并评估了被膜结构，结果表明MGT2的表达通过调节细胞内Mg2+含量，增加GAL7-MGT2突变株在肺组织中的细胞存活。
参考文献
SuoCH,MaLJ,LiHL,SunJF,LiC,etal.InvestigationofCryptococcusneoformansmagnesiumtransportersrevealsimportantroleofvacuolarmagnesiumtransporterinregulatingfungalvirulencefactors.Microbiologyopen.Dec15.
文案转录调控事业部
推荐阅读
转录组的新发现：一氧化氮竟然可以增强灵芝对热应激的抗性！
-01-03转录调控事业部
高通量测序携手SSR和KASP解读家山黧豆的基因密码
-12-26转录调控事业部
派森诺生物
上海派森诺生物科技股份有限公司成立于年4月，是一家致力于为健康医学、生命科学等领域提供基因测序技术服务的高新技术企业。公司年通过高新技术企业认证，公司下设独立医学检验所，并于年获卫计委颁发的《医疗机构执业许可证》，年公司挂牌新三板（证券简称派森诺；代码），年入驻国家健康医疗大数据（南京）中心。
公司在上海、南京、青岛等地设有4家全资子公司，建有完备的健康医学和生命科学研究服务体系，拥有Illumina、Life、PacBio等先进的基因测序平台，是国内少数同时运营Sanger测序、NGS和SMRT测序平台的企业。公司在肠道微生物测序、基因组测序、转录组测序领域处于行业领先水平，具有自主研发技术和成果，已取得授权及受理发明专利、软件著作权余项，合作项目论文多次发表在Nature、Lancet等生物科学、医学权威期刊（子刊）。年7月与全国妇联签订合作协议，成为上海、湖北、河南、江西、安徽五省市女性高发肿瘤筛查执行单位。
派森诺始终秉承“解析序列诠释生命”的企业使命，公司业务覆盖全国，远涉澳洲、欧洲和美洲，在国内28个省市成立办事处，与全国多所高校、医院及科研机构建立紧密合作关系。
赞赏
