派森诺项目文章新型隐球菌镁转运蛋白在

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新型隐球菌(C.neoformans)是人类重要的机会性真菌病原体。大量文献表明Mg2+稳态在真菌生物学过程中起重要作用,但是Mg2+在调节人类真菌病原体的毒力因子中的作用仍然大部分未知。本文系统地研究了C.neoformans镁转运蛋白在控制细胞内Mg平衡和毒力相关因子中的功能。作者确定了C.neoformans中的三种镁转运蛋白:Mgt1,Mgt2和Mgt3,并发现GAL7p-Mgt2菌株在葡萄糖存在下显示出显著的Mg依赖性生长缺陷。进一步分析表明,MGT2是酿酒酵母中MNR2的同源物,定位于液泡膜并参与细胞内Mg的转运。转录组分析表明,敲除MGT2差异调节个基因的表达。其中,19个基因受到独立于外源Mg的MGT2敲除的影响。在动物感染模型中,由于囊体结构增大,mgt2突变体在肺组织中表现出提高的真菌负荷。

RNA-seq材料:野生型菌株H99和MGT2敲除菌株GAL7p-MGT2

测序平台:Illumina

测序公司:上海派森诺生物科技股份有限公司

蛋白质系统进化分析鉴定新型隐球菌镁转运蛋白

为了鉴定新生隐球菌中的Mg2+转运蛋白,采用蛋白质系统发育分析。在C.neoformans的蛋白质组数据库中发现了三种酿酒酵母Mg2+转运蛋白同系物,这些被分别重命名为Mgt1,Mgt2和Mgt3。系统发育分析显示,Mgt1与酿酒酵母线粒体Mg2+转运蛋白分组,Mgt2与血管Mg2+转运蛋白具有密切的进化关系,Mgt3与质膜Mg2+转运蛋白相似(图1)。由于许多金属转运蛋白的基因表达受环境金属水平的调控,因此实时PCR检测MGT1,MGT2和MGT3对Mg2+升高反应的内源性表达水平(图2)。数据显示,C.neoformansMg2+转运蛋白编码基因的表达不受环境Mg水平的调控。

图1酿酒酵母和新型隐球菌中镁转运蛋白系统进化树

图2Mg2+升高对内源性MGT1,MGT2和MGT3表达水平的影响

突变体菌株确定Mg转运蛋白维持Mg2+平衡的功能

使用靶向同源整合方法构建Mg2+转运蛋白敲除菌株,获得mgt1Δ,mgt3Δ和mgt1Δmgt3ΔMgt2;通过在MGT2ORF的起始密码子之前插入的新生隐球菌半乳糖调节启动子(GAL7,CNAG_:编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的基因)取代MGT2启动子,构建了GAL7p-MGT2菌株。与野生型菌株相比,mgt1Δ,mgt3Δ和mgt1Δmgt3Δ菌株具有相似的细胞生长速率。当Mg补充到培养基中时,GAL7p-MGT2菌株的细胞生长得到挽救,但不与其他金属一起(图3a和b)。使用原子吸收光谱测量细胞镁含量,数据显示GAL7p-MGT2菌株中Mg2+含量降低了50%(图3c)。这些结果强烈表明,Mgt2蛋白是参与细胞内镁积累的关键新型隐球菌Mg转运蛋白。

图3Mg转运蛋白突变体的生长表型

新型隐球菌的Mgt2定位在液泡膜

为了评估Mgt2是否功能上类似于Mnr2,构建了可以在半乳糖诱导型启动子的调节下表达GFP-Mgt2嵌合蛋白的GAL7p-GFP-MGT2菌株。GAL7p-GFP-MGT2菌株在YPD(酵母蛋白胨右旋糖)上产生与GAL7p-MGT2菌株相似的生长表型,且在半乳糖存在下补充生长表型(图4a),表明这是GFP-Mgt2蛋白特异性的功能。使用共聚焦显微镜来显示GFP-Mgt2定位于液泡膜(图4b)。液泡特异染料FM4-64和GFP的荧光信号共定位在液泡膜上,表明Mgt2是液泡Mg2+转运蛋白(图4c)。

图4C.neoformansMgt2是一种液泡镁转运蛋白

RNA-Seq验证Mgt2调节独立于Mg的基因表达

抑制MGT2的表达导致个基因的差异表达。在所有差异表达的基因中,MGT2的表达在GAL7p-MGT2细胞中最显着下调。将Mg添加到GAL7p-MGT2菌株的培养基中,与仅在YPD中的GAL7p-MGT2细胞相比,引起GO富集的显着变化。然而,不论Mg处理如何,在这两个条件下,都有四个GO条件保持不变,而这些GO条件在碳水化合物转运,单一生物转运,单一生物定位和有机物质转运方面显着富集(图5b)。在存在或不存在外源Mg的情况下,YPD中GAL7p-MGT2细胞中19个基因的表达保持不变,并且包括MGT2本身。对19个基因中的5个随机选择的预测靶基因进行实时PCR以评价RNA-seq数据,其表达调控模式与RNA-seq分析中获得的类似(图6)。

图5RNA-Seq实验设计及测序结果的GO富集和Venn图分析

图6RT-PCR验证RNA-Seq测序结果

小鼠体内验证Mgt2影响新型隐球菌在肺中的存活

通过统计突变体mgt1Δmgt3Δ或GAL7p-MGT2菌株感染C57BL/J小鼠存活率,检测肺中两个独立的GAL7p-MGT2菌株的真菌增殖水平等一系列实验,结果表明Mgt2可能参与被膜形成。为了进一步了解Mgt2影响肺部真菌增殖的机制,作者分析了GAL7p-MGT2菌株中的黑色素和被膜形成,并表明Mg2+是C.neoformans黑色素形成的关键因素,Mgt2是必需的。后续又构建了Mgt2过表达菌株,检测Mg2+浓度并评估了被膜结构,结果表明MGT2的表达通过调节细胞内Mg2+含量,增加GAL7-MGT2突变株在肺组织中的细胞存活。

参考文献

SuoCH,MaLJ,LiHL,SunJF,LiC,etal.InvestigationofCryptococcusneoformansmagnesiumtransportersrevealsimportantroleofvacuolarmagnesiumtransporterinregulatingfungalvirulencefactors.Microbiologyopen.Dec15.

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